Základní podmínkou je, aby probíhala určitá interakce mezi separovanou látky a stacionární fází za podmínek určených povahou mobilní fáze. Mobilní fáze obsahující směs rozpuštěných chemických látek (analyzovaná reakční směs, vzorek) prochází stacionární fází podél kolony a dochází k ustavování rovnováhy, tz. poměrem mezi adsorbovaným množstvím separované látky a jejím množstvím v procházející mobilní fázi. Důsledkem je rozdílná rychlost a rozdílný čas průchodu kolonou pro různé látky, tento čas se označuje jako retenční.
Po průchodu kolonou je třeba výstup analyzovat, použít typ detektoru, který dokáže na základě odlišného chování separovaných látek a mobilní fáze zaznamenat změnu chování a tuto změnu vyhodnotit a převést na chemicky srozumitelnou veličinu, tedy například na okamžitou koncentraci. Toho se často dosahuje na základě kalibrace, kdy se vyhodnocují odezvy na základě určených koncentrací.
Popis systému HPLC
Vysokotlakým čerpadlem se dávkuje mobilní fáze do kolony, před vstupem do kolony je přidáván vzorek a po průchodu kolonou dochází k detekci a vyhodnocení.
1. Mobilní fáze je při tzv. isokratických podmínkách tvořena jednou látkou. Při gradientové eluci je to směs kapalin, jejichž vzájemný poměr je v průběhu procesu měněn tak, aby se postupně zvyšovala eluce sledovaných látek. V mobilní fázi je na začátku vyšší podíl látky s nízkou sílou eluce, v průběhu separace roste podíl látky s vyšší eluční silou. Průběh, jakým se změna odehrává může být spojitý i skokový, lineární, většinou empiricky zjištěný. V případě gradientové eluce je třeba volit detektor, který není ovlivňován měnícími se parametry mobilní fáze.
2. Stacionární fáze může dělit směs na základě velikosti molekul, nicméně účinnost takové separace je nízká, bývá to zpravidla příprava směsi pro vlastní separaci. Proto bývá stacionární fáze tvořená upraveným silikagelem. Nepolární fáze je obvykle ukotvený alifatický řetězec na silikagelu, zvýšené polarity stacionární fáze se dosahuje začleněním polárních skupin do uhlíkatého řetězce. Náplní kolony může být i ionex. Polarita stacionární fáze a polarita separovaných látek určují retenční čas.
3. Po průchodu kolonou se směs analyzuje detektorem, kde je zaznamenáván rozdíl v odezvě čisté mobilní fáze a odezvě okamžitého průtoku. Nedokonalostí detektorů vzniká šum základní čáry, proměnná "nulová" odezva detektoru v čase. Vlivem změn pracovních podmínek se mění sklon základní čáry. Nejčastějšími detektory jsou UV/VIS, měří se absorbance v UV a viditelné oblasti spektra. Při hmotnostní detekci se výstup z kolony ionizuje a v analyzátoru dělí na základě hmotnosti a náboje. U fluorescenčního detektoru se měří emitované záření, elektrochemický detektor měří změny elektrických parametrů. Typů detektorů je více, podle povahy analyzovaných látek je třeba vybírat vhodný typ.
Z výše zmíněného textu vyplývá, že dalším krokem po výběru rozpouštědla pro separaci sledovaných látek je jeho čistota, tedy vlastnosti, které ovlivní spolehlivost detekce. Je proto nezbytné, aby detektor neměl problém s kvalitou odezvy. Pokud například mobilní fázi tvoří acetonitril a detekce je měřena při 220 nm, bude pravděpodobně stačit kvalita HPLC, při nižších hodnotách vlnových délek je třeba vybrat kvalitu gradientovou, kde vyšší čistota znamená nižší absorbanci. Pro detektory s chemickou, vodivostní detekcí jsou důležité zbytkové nečistoty, což se většinou pozná při odzkoušení vybraného materiálu pro mobilní fázi. U LC-MS jsou důležité zbytky kovů v rozpouštědle, kde mohou vznikat adukty a výsledky analýzy zhoršovat, a také zbytkové vysokomolekulární látky, které se moho postupně z kolony vymývat.
Po odladění podmínek pro separaci a výběru vhodné mobilní fáze je velice důležité, aby kvalita dodávaného rozpouštědla byla přibližně konstantní a spolehlivá. To znamená, při práci se známým materiálem se dá očekávat stálá hodnota šumu a pozadí a tuto chybu odfiltrovat. Proto je často lepší pracovat s o málo horší kvalitou mobilní fáze, ale kvalitou konstantní.
Pokud máte zájem o nabídku HPLC rozpouštědel, prohlédněte náš on-line katalog, podívejte se na zvláštní nabídku HPLC nebo nás prostě jen kontaktujte.
