Limitace iontové suprese pro separaci ionizovaných sloučenin vedla k rozvoji iontově párové chromatografie (IPC). IPC je typem RP-HPLC, ve které jsou do mobilní fáze přidávána iontově párová činidla, kde podporují tvorbu iontových párů s nabitými analyty, které tvoří reversní fázi kolony vhodnou pro separaci iontových molekul. Retence/separace následuje po dynamické kombinaci výměnných mechanismů s reversní fází a výměny iontový pár-ion.

IPC bývá často používána pro separaci bazických sloučenin (obsahujících dusík), jako jsou biogenní aminy. Tyto sloučeniny poskytují v běžné RP-HPLC velmi často nevýrazný pík. Ani technika iontové suprese není vhodná, jelikož by vyžadovala použití tlumené mobilní fáze o pH>8, která není kompatibilní s většinou standardních kolon pro reversní fázi. V takovýchto případech je nejlepší volbou právě iontově párová chromatografie.

V dnešní době je IPC široce používána v oblasti farmaceutického výzkumu pro separaci a identifikaci biologických látek, poněvadž většina těchto sloučenin je svou povahou iontová.

Iontově párová činidla se skládají z dlouhých lineárních alkylových řetězců (od C3 do C16) a iontové skupiny, která se může reverzibilně adsorbovat na alkylové řetězce (C8 nebo C18) RP fáze za vzniku dynamického iontoměniče, na kterém lze separovat iontové sloučeniny.

Existují dva hlavní typy iontově párových činidel: aniontové alkyl-sulfonáty pro zásadité sloučeniny (např. biogenní aminy) a kationtové kvartérní aminy pro kyselé sloučeniny (např. nukleotidy), přičemž první z nich jsou používány rozsáhleji.

Běžně používanými alkyl-sulfonáty IPC jsou sodné soli kyselin 1-hexansulfonové, 1-heptansulfonové a 1-oktansulfonové.

Selektivita systému silně závisí na výběru a množství činidla tvořícího iontové páry v mobilní fázi. Činidla s dlouhými řetězci budou podstatně lépe adsorbována na RP fázi, což zvýší retenci. Nevýhodou je čas potřebný k ustavení rovnováhy, které je u delších řetězců (>C12) dosaženo pomaleji.

Iontově párová činidla se běžně přidávají v nízkých koncentracích (typicky mezi 2 a 10 mmol) do mobilní fáze, která se skládá z organického eluentu či eluentů a vodného roztoku tlumiče. Poměrně často je separace sloučenin ve složité směsi prováděna v gradientu rozpouštědla s rostoucí koncentrací organických eluentů v mobilní fázi („rozpouštědlo A & B“). Je vhodné přidávat stejnou koncentraci iontově párového činidla do obou rozpouštědel za účelem zachování konstantní koncentrace činidla pro stacionární fázi během změny gradientu. V tomto případě je zásadní použití vysoce kvalitních rozpouštědel a přísad v mobilní fázi. Rozpouštědla kvality HPLC jsou vhodná, ale může být obtížné najít tlumící sůl a iontově párové činidlo stejné kvality.

Na závěr je možné říci, že iontově párová chromatografie je velmi selektivní a výkonná separační metoda, která ovšem vyžaduje zvláštní pozornost jak během dalšího vývoje, tak pro každodenní běžnou praxi v procesu spouštění kolony, postupech pro složení mobilní fáze a procesech vedoucích k ustavení rovnováhy v systému.

Charakteristiky a výhody alkylsulfonátových IPC činidel od Acros Organics

Acros Organics nabízí rozsáhlou řadu běžně používaných alkylsulfonátových IPC činidel vynikající kvality. Aby byla zajištěna reprodukovatelnost, spolehlivost a přesnost analýzy, je každý produkt testován za přísných podmínek.

1) Nejnižší absorpce UV i při vysokých koncentracích: Z dat v Tabulce 1 je zřejmé, že IPC činidla od Acros Organics mají velmi nízkou absorpci UV směrem dolů k 200 nm i při vysokých koncentracích.

Tabulka 1: UV absorpce alkylsulfonátových IPC činidel od Acros Organics

Výsledky

Účinnost

2) Bez obsahu prachových částic a nerozpustných látek: V rámci charakterizace jsou produkty podrobeny 0,5 mikro-membránovému filtračnímu testu při koncentraci 0,5 M, aby bylo zaručeno, že neobsahují prachové částice a nerozpustné látky.

3) Nejlepší výsledky v gradientové HPLC: Činidla byla podrobena náročným aplikačním testům a vykázala jen velmi malý posun základní linie v gradientové HPLC.

Obr. 1: Gradientový test sodné soli kyseliny 1-hexansulfonové.

Kolona: Zorbax Eclipse Plus (C18, 1,8 μm) 50x4,6 mm

Mobilní fáze:     A: 0,005M bezvodá sodná sůl kyseliny hexansulfonové, ve vodě.

                        B: Acetonitril

Průtok:             Tok: 1,0ml/min.

Teplota:            35.0°C

Detekce:          UV, 205nm

Gradient:          A: Acetonitril.

                        B: 0,005M sodná sůl kyseliny hexansulfonové, ve vodě

4) Aplikační/výkonnostní test: Separace biogenních aminů může být snadno provedena za použití ultračisté sodné soli kyseliny alkylsulfonové. Obr. 2 ukazuje separaci směsi obsahující 4-amidinobenzamid hydrochlorid, 3-hydroxytyramin hydrochlorid, histamin dihydrochlorid a serotonin hydrochlorid.

Obr. 2: Separace biogenních aminů pomocí sodné soli kyseliny 1-hexansulfonové.

Kolona: Zorbax Eclipse Plus (C18, 1,8 μm) 50x4,6 mm

Mobilní fáze:     A: 90 dílů acetonitrilu a 10 dílů 0,005M sodné soli kyseliny hexansulfonové v kyselině fosforečné 0,01M při pH 2,4.

                        B: 0,005M sodná sůl kyseliny hexansulfonové + zředěná kyselina fosforečná pH 2,4.

Průtok:             Tok: 1,5ml/min.

Teplota:            20,0°C

Detekce:          UV, 220nm

Gradient:         

Injektovaný objem:        10μl

Roztok vzorku:              10mg/100ml, Rozpouštědlo: acetonitril/kyselina fosforečná 0,01M (10/90)

Retenční čas:

- 6,9 min: 4-amidinobenzamid hydrochlorid (22440)

- 7,8 min: 3-hydroxytyramin hydrochlorid (12200)

- 8,8 min: histamin dihydrochlorid (15062)

- 11,2 min: serotonin hydrochlorid (21502)

Kvalita

Pohodlí

Výsledky

5) Všechna alkylsulfonátová iontově párová činidla od Acros Organics jsou bezvodá. Koncentrace iontově párových činidel v mobilní fázi hraje důležitou roli v separaci složitých směsí. Nepatrná změna koncentrace o 10-20% může změnit retenční čas, což může vést k nesrovnalostem v řešení překrývajících se píků. Bezvodá forma výrazně zjednodušuje přípravu mobilní fáze o žádoucí koncentraci, a tím zvyšuje reprodukovatelnost metody.

6) Velikost balení: Vzhledem k tomu, že je IPC stále oblíbenější metodou separace polárních a iontových směsí, nabízíme nyní větší balení, abychom našim zákazníkům pomohli snížit výdaje a ušetřit čas eliminací nadbytečného ověřování metody kvůli změně šarže iontově párového činidla.

Poděkování: Díky panu Nico Vonkovi z Avans (Breda, Nizozemsko) za jeho příspěvek k článku.

Seznam výrobků alkylsulfonátových iontově párových činidel od Acros Organics